5 HAL TERATAS YANG PERLU DIKETAHUI UNTUK SUKSESNYA FERMENTASI “PICHIA”

by Admin

Posted on 2021-05-28 16:30:17



Beberapa faktor kunci penting untuk keberhasilan fermentasi pichia pastoris. Berikut ini gambaran singkat dan sederhana tentang apa yang dibutuhkan untuk optimasi proses dalam kaitannya dengan kapabilitas perangkat keras yang digunakan.

Kultur metilotrofik ragi Pichia pastoris adalah mikroba standar dalam bioproses protein rekombinan. Penggunaan komersial pada tahun 1970-an ditujukan untuk menggunakan Pichia sebagai pakan ternak. Sebagai sistem ekspresi, ia memiliki beberapa keunggulan:

  • Ia dapat tumbuh dengan alkohol sederhana (metanol) sebagai satu-satunya sumber karbon.
  • Ini dapat digunakan sebagai bagian dari sistem ekspresi yang biasanya menyalakan promotor Aox1 untuk produksi protein setelah periode pertumbuhan gliserol.
  • Ia dapat tumbuh hingga kepadatan sel yang tinggi, meningkatkan biomassa per batch. Hasil protein bisa dalam kisaran gram per liter.
  • Protein diekspresikan ke dalam medium, sehingga mengurangi jumlah proses hilir yang diperlukan untuk pemulihannya.
  • Karena kemampuannya untuk mengglikosilasi sebagian protein, ia direkayasa untuk menghasilkan protein yang biasanya ditemukan dalam kultur sel hewan.

Budidaya Pichia dalam bioreaktor hadir dengan beberapa tantangan:

  • Diperlukan kecepatan transfer oksigen yang tinggi untuk mencapai kepadatan sel yang tinggi. Ini melibatkan pencampuran kecepatan tinggi pada laju aliran gas tinggi dan / atau suplementasi dengan oksigen murni.
  • Laju pertumbuhan dan kepadatan sel sedemikian rupa sehingga banyak panas berlebih yang dihasilkan oleh kultur, selain yang dihasilkan oleh pencampuran berkecepatan tinggi. Keluaran panas terbesar saat lonjakan metanol terjadi selama pengumpanan.
  • Saat konsentrasi protein meningkat, pembentukan busa dapat menjadi masalah dan pemberian dosis dengan agen antifoam atau penggunaan pemecah busa mekanis mungkin diperlukan.
  • Strategi pemberian makan yang berbeda mungkin diperlukan.

Solusi untuk masalah ini bergantung pada kemampuan bioreaktor yang digunakan. Gambaran singkat berikut akan membantu mengisi beberapa detail ini.

KEPADATAN SEL YANG TINGGI MEMBUTUHKAN TRANSFER OKSIGEN YANG BAIK

Kepadatan sel yang tinggi menuntut kecepatan transfer oksigen yang tinggi. Untuk ini diperlukan motor yang kuat dengan ukuran volume kapal, memungkinkan kecepatan tinggi dicapai bahkan dengan volume besar. Ukuran, jenis dan jumlah impeler juga penting. Impeler Rushton berbilah datar berukuran 0,33 diameter bejana optimal untuk bekerja dengan baffle. Gelembung besar dari sparger gas dipecah menjadi banyak gelembung kecil yang meningkatkan luas permukaan untuk transfer gas. Daya tahan dan keandalan sistem penggerak memainkan peran penting dalam fermentasi Pichia karena biasanya berdurasi 60 jam. Lebih dari separuh waktu itu akan berada dalam kondisi beban maksimum.

Kemampuan gas juga penting. Tidak hanya dalam hal volume maksimum secara keseluruhan, tetapi juga tingkat kontrolnya. Katup aliran massa terintegrasi dapat memasok umpan balik dan kontrol untuk pengoptimalan proses. Kemampuan untuk menambah aliran udara dengan oksigen murni dapat memungkinkan kultur Pichia mencapai kepadatan sel yang lebih tinggi daripada dengan udara saja.

Komponen bioreaktor utama yang mendukung transfer oksigen meliputi:

  • Impeler Rushton berbilah datar
  • Sistem pengadukan kinerja tinggi mampu hingga 1200 menit-1
  • Katup aliran massa terintegrasi untuk kontrol aliran gas

PASTIKAN PENDINGINAN KAPAL YANG SANGAT BAIK

Kemampuan untuk mendinginkan wadah terhadap peningkatan suhu yang tiba-tiba dan cepat diperlukan untuk fermentasi Pichia yang berhasil. Ini tergantung pada perbedaan suhu antara kultur dan pendingin, luas permukaan yang bersentuhan dengan perpindahan panas dan laju aliran melalui sistem pendingin. Pendingin yang bersirkulasi dengan pendingin 50/50 propilen glikol hampir pasti dibutuhkan untuk kepadatan sel yang tinggi dan ini dapat dijalankan dengan Delta T hingga 20 ° C.

Kapal berjaket atau blok termal eksternal dapat digunakan. Jika pendinginan tidak memadai, jari dingin dapat ditambahkan ke port yang tersedia untuk menempatkan pendingin lebih dekat dengan cairan kultur. Ini dapat dikontrol dengan loop kontrol suhu yang dimodifikasi untuk dihidupkan sesuai kebutuhan atau pemanasan ulang yang digunakan jika air dingin mengalir terus-menerus melalui jari dingin.

Pilihan pendinginan untuk fermentasi pichia pastoris:

  • Kapal berjaket atau blok termal eksternal
  • Recirculating chiller dengan pendingin 50/50 propylene glycol
  • Jari dingin

ANDA MEMBUTUHKAN KEMAMPUAN MAKAN YANG FLEKSIBEL

Substrat yang digunakan untuk memberi makan kultur Pichia adalah cara biasa untuk mengontrol produksi produksi protein rekombinan. Fase pertumbuhan gliserol atau glukosa menyediakan produksi biomassa yang efisien. Umpan glukosa / gliserol kemudian dialihkan ke Metanol, ini mengaktifkan gen AOX yang memicu produksi protein rekombinan.

Dua pompa dibutuhkan untuk memasok:

  • Gliserol pada tahap awal kultur dibutuhkan untuk meningkatkan biomassa tanpa mengalihkan sumber daya metabolisme ke pembentukan produk. Untuk mendapatkan kepadatan kultur yang tinggi, substrat ini harus dikirim dalam mode batch dan fed-batch. Ini biasanya diikuti dengan periode kelaparan.
  • Metanol ditambahkan sebagai substrat, yang mengaktifkan promotor Aox1 untuk memungkinkan pembentukan produk dimulai. Konsentrasi metanol dapat bervariasi selama fermentasi, karena Pichia beradaptasi dengan substrat baru. Terlalu banyak metanol akan menjadi racun.

Pencampuran gliserol dan metanol sebagai fase antara juga dimungkinkan. Metanol dapat tersedia dalam semburan, dengan periode kelaparan di antaranya atau tingkat pakan dijaga mendekati tingkat kelaparan.

Oleh karena itu, diperlukan pompa peristaltik yang mampu memberikan pengiriman yang tepat di berbagai tingkat aliran. Pompa dapat dialokasikan ulang untuk mengirimkan umpan daripada misalnya, antifoam. Dalam contoh ini, hilangnya pompa antifoam dapat dikurangi dengan menambahkan reagen antifoam tingkat rendah ke dalam umpan, atau dengan menambahkan pemecah busa mekanis pada antarmuka cairan / gas.

GUNAKAN KONTROL PROSES OTOMATIS

Kontrol lokal di bioreaktor yang dimediasi oleh Human Machine Interface (HMI) akan memberikan opsi untuk kontrol kaskade oksigen terlarut di beberapa parameter berbeda. Pengendalian dapat dimulai dengan kecepatan pengaduk dan kemudian dialirkan ke aliran udara ketika telah mencapai maksimum yang ditentukan pengguna. Langkah selanjutnya adalah menggunakan pencampuran gas untuk menambah aliran udara dengan oksigen. Ini tidak memerlukan campur tangan pengguna dan menghasilkan respons yang dinilai dengan cermat terhadap kondisi yang berubah.

Contoh kaskade untuk mengontrol oksigen terlarut:

  1. Tingkatkan kecepatan pengaduk
  2. Tingkatkan aliran udara
  3. Tambahkan oksigen ke campuran gas

Selain itu, penggunaan perangkat lunak kontrol bioproses dapat membawa tingkat otomatisasi ke tingkat yang baru. Sekarang menjadi mungkin untuk mencari lonjakan oksigen terlarut (yang menunjukkan semua substrat telah digunakan oleh sel) dan menggunakannya untuk secara otomatis mengubah umpan dan / atau memulai pemberian makan berdenyut. Kontrol alur kerja dapat membagi proses menjadi beberapa fase dan memiliki kondisi operasi yang berbeda untuk setiap fase. Ini bisa linier atau berulang untuk mengulangi langkah-langkah tertentu.

Selain itu, sensor fisik di dalam atau di sekitar pembuluh dapat memasok data tentang pertumbuhan dan metabolisme sel. Sensor lunak dapat menggunakan pembacaan sederhana dari sensor fisik untuk menghitung nilai tidak langsung lainnya yang lebih terkait dengan metabolisme sel. Faktor-faktor ini kemudian dapat mengubah parameter kontrol secara real-time.

Bioreactor and Bioprocess Control Software

 

GUNAKAN SENSOR UNTUK PENGUKURAN KEPADATAN SEL YANG LEBIH BAIK

Memperluas kemampuan bioreaktor dasar dengan lebih banyak sensor merupakan keuntungan besar bagi kultur Pichia. Dua yang paling banyak digunakan adalah:

  • Kepadatan optik: Pengukuran didasarkan pada absorbansi kultur pada panjang gelombang tertentu (~ 600nm) dan dapat dinyatakan dalam satuan kepadatan optik atau OD600. Sebuah probe terletak di dalam kapal untuk melakukan pengukuran secara real-time. Kepadatan optik dapat menunjukkan masalah apa pun dengan strategi pertumbuhan atau memberikan pemicu untuk memulai fase kelaparan ketika kepadatan sel tertentu telah tercapai.
  • Analisis gas keluar: Penganalisis mengambil sampel gas yang keluar dari bioreaktor dan mengukur jumlah oksigen dan karbon dioksida yang ada sebagai persentase dari total campuran gas. Karena jumlah gas yang masuk ke dalam pembuluh diketahui, perbedaannya berkaitan dengan metabolisme sel. Mengirimkan nilai-nilai ini ke sensor lunak yang dibuat dalam perangkat lunak bioproses akan memungkinkan parameter metabolik seperti Respiratory Quotient (RQ) dihitung. Ini dapat menentukan efisiensi proses metabolisme yang terjadi di dalam sel. Sebagai langkah terakhir, nilai yang dihitung ini dapat digunakan untuk mengontrol kecepatan pengumpanan media dan membuat penyesuaian otomatis dari waktu ke waktu.

KESIMPULAN: BEBERAPA FAKTOR KUNCI PENTING UNTUK KEBERHASILAN FERMENTASI PICHIA PASTORIS

Ini telah menjadi gambaran singkat dan sederhana tentang fermentasi Pichia untuk pendatang baru. Poin utama telah difokuskan pada apa yang dibutuhkan untuk optimasi proses dalam hal kapabilitas perangkat keras yang digunakan.

Faktor kunci yang diidentifikasi sebagai penting adalah:

  • Kebutuhan akan motor penggerak yang kuat dan sistem impeler yang dioptimalkan untuk memastikan tingkat transfer oksigen yang tinggi. Kecepatan lebih dari 1.200 rpm harus dimungkinkan.
  • Pentingnya pendinginan yang efisien untuk menghilangkan panas dari kultur Pichia dengan kepadatan tinggi
  • Kebutuhan akan pompa dengan akurasi tinggi yang dapat dialokasikan kembali untuk fermentasi Pichia 'di luar kotak'
  • Pentingnya perangkat lunak kontrol lokal dan pengawasan untuk otomatisasi dan pengoptimalan
  • Nilai sensor tambahan untuk mendeteksi laju pertumbuhan sel dan / atau proses metabolisme, terutama jika digabungkan dengan sensor lunak.

Nilai untuk laju pertumbuhan, hasil, dll. Dapat ditemukan dalam catatan aplikasi terkait yang tersedia dari INFORS-HT: Karakterisasi biologi dan rekayasa proses dari bioreaktor laboratorium Minifors 2.

Ditulis Oleh: Tony Alman (21 May 2021)

Sumber: https://www.infors-ht.com/en/blog/the-top-5-things-to-know-for-successful-pichia-fermentation/

#infors #bioreactor #pichiafactoris #alatlab #laboratorium